Методические указания Методические указания по проведению санитарно-бактериологического анализа воды с использованием систем индикаторных бумажных (СИБ)

Министерство жилищно-коммунального хозяйства РСФСР

Ордена Трудового Красного Знамени
Академия коммунального хозяйства им. К.Д. Памфилова

Согласовано Зам. Главного Государственного санитарного врача РСФСР Г.А. Аввакумов (письмо № 07 (ВК 17-71 от 01.02.84 г.)

Утверждено приказом Министерства жилищно- коммунального хозяйства РСФСР от 21 января 1987 г. № 38

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ПРОВЕДЕНИЮ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА ВОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ
ИНДИКАТОРНЫХ БУМАЖНЫХ
(СИБ)

Издание второе

Москва 1988

СОДЕРЖАНИЕ

Общие положения . 1 Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды .. 2 Характеристика сиб . 2 Способы применения сиб . 2

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Важная роль санитарно-микробиологического контроля окружающей среды в профилактике кишечных инфекций обусловливает актуальность разработки новых и совершенствования существующих методов индикации санитарно-показательной микрофлоры.

Как известно, показателем степени фекального загрязнения служит количество бактерий группы кишечных палочек, определяемое в 1 л воды (коли-индекс). Проведение санитарно-бактериологического анализа питьевой воды регламентировано в настоящее время ГОСТ 16963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа" и ГОСТ 24849-81 "Вода питьевая. Полевые методы санитарно-микробиологического анализа". В качестве этапа накопления бактерий используют два метода - титрационный и мембранных фильтров Выращивание микроорганизмов производят на дифференциально-диагностических лактозосодержащих средах типа Эндо. Для дальнейшего исследования отбирают колонии, характерные для бактерий группы кишечных палочек, которые идентифицируют по ограниченному количеству ключевых тестов: к бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 ± 1,0 °С в течение 5 - 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.

В некоторых случаях при определении коли-индекса необходимы дополнительные исследования на наличие бактерий - показателей свежего фекального загрязнения (кишечных палочек, способных ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 ± 1,0 °С и образовывать индол при этой же температуре).

Таким образом, при санитарно-бактериологическом исследовании питьевой воды решающими являются биохимические тесты: наличие оксидазной активности, характер ферментации глюкозы и лактозы и способность образовывать индол.

Эти свойства кишечных палочек в соответствии с упомянутыми ГОСТами определяются с использованием дефицитных реактивов и дифференциально-диагностических сред, имеющих срок хранения от 7 сут до 1 мес, а реактив для определения оксидазной активности готовят непосредственно перед определением.

На основании проведенных исследований для выявления оксидазной активности, характера ферментации, глюкозы и лактозы, а также индолообразования рекомендуется использовать СИБ Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии взамен применяемых реактивов и дифференциально-диагностических сред по ГОСТ 18963-73.

Преимущества применения СИБ по сравнению с общепринятыми методами заключаются в простоте и ускорении анализа вследствие исключения этапа приготовления реактивов и дифференциально-диагностических сред, а следовательно, и потребности в дефицитных ингредиентах. Особое значение приобретает работа с СИБ при выполнении анализов в полевых условиях вне стационарной лаборатории.

АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Аппарат для фильтрования; автоклав электрический по ГОСТ 9586-75; термостаты электрические для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до 50 °С и термометром с ценой деления 0,2 °С.

Пробирки бактериологические по ГОСТ 10515-75; чашки бактериологические (Петри) по ГОСТ 10973-75; вата гигроскопическая медицинская по ГОСТ 5556-75; проволока из никелевых сплавов диаметром 0,3 - 0,5 мм по ГОСТ 492-73; фильтры мембранные № 2 и 3, выпускаемые Мытищинской экспериментальной фабрикой ультрафильтров по ТУ-204 РСФСР-953-78 "Владипор" марки МФА-МА 5-8, выпускаемые производственным объединением "Тасма" им. В.В. Куйбышева по ТУ-6-05-1003-81 и др.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72; спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5932-67.

Агар сухой питательный по ГОСТ 11206-71; пептон сухой для бактериологических целей по ГОСТ 13805-68; СИБ с глюкозой, с лактозой, на оксидазу и на индол по ТУ-42.14.128.73; среда Эндо сухая питательная.

ХАРАКТЕРИСТИКА СИБ

Системы индикаторные бумажные представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами и покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером - водным раствором поливинилового спирта.

СИБ с глюкозой и лактозой представляют собой диски диаметром 0,8 - 1,0 см, СИБ на оксидазу выпускается в виде полосок размером 8 ´ 1 см или дисков диаметром 3,5 ´ 4,0 см, СИБ на индол - в виде полосок размером 8 ´ 1,0 см. Срок годности СИБ указан на этикетках (2 года).

СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ СИБ

Определение оксидазной активности бактерий

Постановка оксидазного теста при работе бродильным методом

По 2 - 3 изолированные колонии каждого типа, выросшие на секторах чашки со средой Эндо, снимают частично петлей и наносят штрихом на диск СИБ-оксидазы (диск помещают в чашку Петри). Оставшуюся часть колонии используют для изучения ферментации глюкозы. При положительной реакции в месте нанесения культуры бумажка синеет в течение 1 мин, при отрицательной - цвет ее не изменяется. В ряде случаев оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, особенно при исследований колоний, окрашенных в темно-красный цвет. В таких случаях нужно пересеять колонии со среды Эндо на сектор чашки с питательным агаром или на скошенный питательный агар и после подращивания при температуре 37 ± 1,0 °С в течение 3 - 5 ч пробу повторить.

Постановка оксидазного теста при работе методом мембранных фильтров

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом, не переворачивая на бумажный диск СИБ-оксидазы диаметром 3,5 - 4,0 см (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 3 - 4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии, а также колонии с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae , их не учитывают. Мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо, и немедленно (не позднее 5 мин) пересеивают оксидазоотрицательные колонии по 2 - 3 колонии каждого типа для определения ферментации глюкозы.

Определение характера ферментации глюкозы

Определение характера ферментации глюкозы на плотной питательной среде (чашечный метод)

В чашку Петри тонким слоем (10 мл) наливают питательный агар рН 7,2 - 7,8 (не ниже 7,2). Подозрительные на кишечную палочку колонии засевают петлей на сектор чашки по ее периферии. На одной чашке может быть исследовано до 6 - 8 культур. На место посева (площадка около 0,5 см²) накладывают диск СИБ-глюкозы. Для улавливания газообразования и фиксации диск а последний заливают несколькими каплями расплавленного и остуженного до 40 - 45 °С полужидкого агара (0,6 - 0,8 %). Инкубируют при температуре 37 ± 1,0 °С. При разложении глюкозы до образования кислоты цвет диска меняется из красного в желтый. При наличии газообразования пузырьки газа скапливаются по краям диска и между диском и агаром. В качестве контроля необходимо использовать диски без посева культуры. Красный цвет их не меняется. Различие в цвете контрольных и опытных дисков служит для сравнения при учете реакции.

Результаты учитывают в течение 3 - 5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности культуры. Возможен второй вариант определения характера ферментации глюкозы на плотной питательной среде. В чашку Петри толстым слоем (20 мл) наливают агар с рН 7,2-7,8 (не ниже 7,2). Диски СИБ-глюкозы стерильно разрезают пополам. Половину диска берут пинцетом, острым краем диска забирают подлежащую изучению колонию и вводят в толщу агара под углом к поверхности. На одной чашке может быть исследовано до 10 колоний. При этом не следует допускать образования пузырьков воздуха и опускания диска до дна чашки. Посевы инкубируют при температуре 37 ± 1,0 °С. При разложении глюкозы до образования кислоты цвет диска и окружающей среды меняется из красного в желтый. При образовании газа он скапливается по поверхности диска и между диском и агаром. В качестве контроля используют диск СИБ-глюкозы без культуры. Красный цвет его и окружающей среды не меняется.

Результаты учитывают через 1 - 5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности бактерий. При образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При наличии только кислоты или отсутствии кислоты а газа получают отрицательный результат. В обоих вариантах определение заканчивают через 5 ч. Позже учитывать результаты реакции в ряде случаев затруднительно, так как через 5 - 6 ч начинается подщелачивание среды за счет протеолиза белков, желтая зона вновь розовеет и приобретает первоначальный красный цвет.

Определение характера ферментации глюкозы в жидкой питательной среде (пробирочный метод)

В пробирки с 1 мл 0,5 %-ной пептонной воды или питательного бульона (рН 7,4 - 7,8) и небольшим клочком гигроскопической ваты вносят петлей изучаемую колонию и пинцетом диск СИБ-глюкозы. Для ускорения ответа пробирки со средой можно подогреть до температуры 37 °С. Среда в пробирках в результате быстрой диффузии в нее индикатора, импрегнированного в бумаге, становится красной. Посевы инкубируют при температуре 37 ± 1,0 °С. При ферментации глюкозы с образованием кислоты и газа среда приобретает желтый или оранжевый цвет, а пузырьки газа скапливаются между волокнами ваты. В качестве контроля используют пробирки со средой и СИБ-глюкозой без культуры.

Результаты учитывают в течение 1 - 5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности бактерий. При образовании кислоты и газа результат считают положительным. Отсутствие кислоты и газа свидетельствует об отрицательном результате. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Отсутствие газообразования через 24 ч позволяет дать окончательный отрицательный ответ, наличие газообразования - положительный.

Определение бактерий-показателей свежего фекального загрязнения

Изучение ферментации лактозы и образования индола осуществляется раздельно в двух пробирках: в одной - ферментация лактозы, во второй - образование индола.

При определении лактозной активности в пробирку с 1 мл 0,6 %-ной пептонной воды или питательного бульона (рН 7,4 - 7,8) и небольшим клочком гигроскопической ваты помещают пинцетом диск СИБ-лактозы. Пробирки подогревают до температуры 44 °С, затем в них петлей засевают исследуемые колонии. Среда в пробирках становится красной в результате диффузии в нее индикатора, импрегнированного в диске. Посевы инкубируют при температуре 44 ± 0,5 ° С. При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа среда приобретает желтый или оранжевый цвет, а пузырьки газа скапливаются между волокнами ваты.

При определении индолообразования в пробирки с 1 мл 0,5 %-ной пептонной воды или питательного бульона (рН 7,4 - 7,8), предварительно подогретые до температуры 44 °С, петлей засевают исследуемые колонии и вносят полоски СИБ-индола. Индикаторную полоску складывают по коричневой разделительной полосе вдвое и пинцетом опускают на дно пробирки так, чтобы большой бесцветный конец погружался в среду, а короткий конец, имеющий желтую окраску, находился над поверхностью среды. Вследствие образования индола короткий конец индикаторной полоски меняет желтый цвет на розовый или ярко-малиновый. В качестве контроля используют пробирки со средой, содержащие СИБ с лактозой или СПБ на индол, без культуры. Цвет их при инкубации не меняется. В обоих случаях (как при изучении ферментации лактозы, так и образования индола) результаты учитывают в течение 3 - 5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности бактерий. В случае необходимости учет результатов можно проводить через 8 - 24 ч (желтый цвет среды, пузырьки газа и розово-малиновый цвет индикаторной полоски сохраняются). При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа и при образовании индола результат считают положительным. Отсутствие кислоты, газа и индола свидетельствует об отрицательном результате. В случае образования только кислоты или кислоты и газа без индола пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Отсутствие газообразования или индола через 24 ч позволяет дать отрицательный ответ, наличие кислоты, газа и индола - положительный.

Примечания . 1. Исследования проводят с колониями, выросшими на мембранном фильтре или на плотной питательной среде.

2 . Аппликацию (введение) СИБ в плотную среду или в пробирки с жидкой средой производят обожженным пинцетом.

3 . Критерием правильности учета реакции ферментации глюкозы, лактозы и образования индола при использовании СИБ должны быть четкие различия в окраске по сравнению с контролем (СИБ в среде без посева культуры).

4 . Для определения активности оксидазы можно использовать тот же сектор чашки, на котором изучается ферментация глюкозы. Дополнительный посев культуры при этом рекомендуется проводить на участие сектора, расположенного ближе к центру чашки.

5 . Основные дефекты при применении СИБ-глюкозы и СИБ-лактозы зависят от несоблюдения режима рН, от использования посуды, обработанной различными моющими средствами и недостаточно отмытой от них, от несоответствия фактических данных сухих сред указанным на этикетках и т.д.